Beschreibung

• Membranfusion innerhalb des endolysosomalen Wegs eukaryontischer Zellen ist notwendig, um Rezeptoren der Plasmamembran abzubauen oder Recycling von zellulären Komponenten durch lysosomal Verdau zu ermöglichen. Zwei große heterohexamere Komplexe, CORVET und HOPS, die wahrscheinlich als Fusionskoordinatoren an Endosomen und Lysosomen wirken, konnten in Hefe identifiziert und charakterisiert werden. Obwohl die meisten Untereinheiten dieser Komplexe auch in vielzelligen Tieren (Metazoen) zu finden sind, fehlt bisher immer noch eine adäquate Reinigung und funktionelle Analyse der homologen Komplexe. Daher ist es nach wie vor unklar, ob die Beobachtungen aus Hefe auf Zellen von Vielzellern übertragen werden kann. In Anbetracht der Bedeutung der HOPS und CORVET Untereinheiten für die endosomale und lysosomale Biogenese, unter anderem bei der zellulären Signalübertragung und während der Entwicklung, wollten wir hier in einem kombinierten Ansatz die Funktion von CORVET und HOPS in Vielzellern klären.Im ersten Teil diese Projektes (Aim 1) planen wir, den HOPS und CORVET Komplex aus menschlichen Zellen und Drosophila Fliegen zu isolieren und charakterisieren. Wir werden hierzu die Komposition und Größe jedes Komplexes bestimmen, mögliche neue Interaktionspartner identifizieren und, soweit vorhanden, deren Bindestelle am HOPS oder CORVET klären. Damit werden wir auch herausfinden, ob höhere Zellen mehr heterohexamere Fusionskomplexe haben als die in Hefe beschriebenen HOPS und CORVET. Im zweiten Teil (Aim 2) sollen rekombinanter HOPS und CORVET aus Mensch oder Drosophila in Proteoliposomen-Fusionstests analysiert werden. Hierzu planen wir, alle Untereinheiten in einem heterologen Expressionssystem herzustellen und zu reinigen. In diesem Ansatz können auch mögliche neue Interaktionspartner getestet werden. Im dritten Teil (Aim 3) werden wir die Funktion von CORVET und HOPS in Drosophila im Detail untersuchen, um deren Funktion bei endosomaler Biogenese und Organentwicklung zu klären. Wir werden hierzu knock-down Ansätze und Ko-expressionsanalysen nutzen, um die jeweilige Lokalisierung und Funktion beider Komplexe zu klären. Das schließt eine Analyse von Drosophila Vps8 mit ein, das bisher noch nicht untersucht wurde. Da Mutationen in HOPS und CORVET Untereinheiten zu deutlichen Entwicklungsfehlern und Krankheiten führen, ist ein detailliertes Verständnis der beiden Komplexe notwendig, um zukünftig medizinische Interventionen zu ermöglichen.