Beschreibung

• Autophagosomen bilden sich als Organelle de novo und müssen daher die für die Bindung und Fusion mit der Vakuole erforderlichen Maschinen rekrutieren. Im Rahmen dieses Projekts werden wir versuchen, die Mechanismen und Maschinerie zu entschlüsseln, die der Reifung und Fusion zugrunde liegen. Unser Schwerpunkt wird daher auf dem Tethering und der Regulation der GEFs Mon1-Ccz1 bei der Rekrutierung von Ypt7 auf Autophagosomen (Ziel 1) liegen, während der zweite Schwerpunkt auf dem Mechanismus der Ykt6-Rekrutierung für Autophagosomen liegt (Ziel 2). Ziel 3 wird sich auf die Optimierung des Autophagosom-zu-Vakuolen-Fusions-Assays und seine Rekonstitution konzentrieren. Im Rahmen von Ziel 1 werden wir zunächst posttranslationale Modifikationen von Mon1-Ccz1 sowohl durch massenspektrometrische Analyse isolierter Proteine vor und während Aminosäure-Mangels von Zellen analysieren, als auch die lokale Umgebung des Proteinkomplexes auf isolierten Autophagosomen durch Proximity-Markierungsanalysen untersuchen. Entsprechende Mutanten von Mon1 und Ccz1 werden auf ihre Funktionalität in Autophagie und Endozytose (als Kontrolle) analysiert, und interagierende Proteine werden mit Hilfe etablierter Assays auf ihre Rolle in der Mon1-Ccz1-Funktion untersucht. Ziel 2 konzentriert sich auf Ykt6 und dessen Funktion auf Autophagosomen. Hier wird untersucht, welche Maschinerie an der Rekrutierung von Ykt6 auf Autophagosomen beteiligt ist, wie die Ykt6-Aktivität an Autophagosomen kontrolliert wird, und wie das Protein nach der Fusion schließlich aus der Vakuolenmembran recycelt wird. In Ziel 3 werden wir uns auf die Rekonstitution der autophagiespezifischen Funktionen von Mon1-Ccz1 und Ykt6 konzentrieren. Dazu werden wir den Autophagosom-Vakuolen-Fusionsassay optimieren, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und es für biochemische Manipulationen besser zugänglich zu machen. Der Schwerpunkt wird auf der Rekonstitution der Autophagosom-Vakuolenfusion mit Proteoliposomen liegen, um die in Ziel 1 und 2 gewonnenen Erkenntnisse auszuwerten und zu erweitern.

Projektlaufzeit

• 01.12.2020 - 30.11.2023